Pruebas de sensibilidad bacteriana in vitro

En la época posterior al descubrimiento de las sulfonamidas y de la penicilina rara vez se probaba la sensibilidad de los microorganismos a las drogas. Los pacientes eran tratados en forma empírica y los microorganismos generalmente eran sensibles. Sólo tras el surgimiento de las cepas resistentes, poco después de la introducción de estos agentes, los microbiólogos comenzaron a probar la sensibilidad de un microorganismo infectante frente a los agentes antimicrobianos.

En un primer momento, el método estándar utilizado para las pruebas in vitro fue el de dilución en caldo, que proporcionaba un resultado cuantitativo de la concentración de agente antimicrobiano necesaria para inhibir el desarrollo de un organismo dado.

Método base de dilución en caldo

En los métodos de dilución en caldo, base de casi todos los métodos utilizados en la actualidad, se colocan concentraciones decrecientes del agente antimicrobiano, generalmente diluciones 1:2, en tubos con un caldo de cultivo que sostendrá el desarrollo del microorganismo. El caldo más comúnmente usado para estas pruebas es el de Mueller-Hinton suplementado con los cationes magnesio y calcio.

Los agentes antimicrobianos se preparan en "soluciones madre" concentradas y luego se diluyen en caldo hasta obtener las concentraciones apropiadas.

Un tubo de caldo se mantiene sin inocular como control negativo de crecimiento. Luego de la incubación adecuada (usualmente de un día para el otro) se observa la turbidez de los tubos que indicará desarrollo bacteriano. El microorganismo crecerá en el tubo control y en todos los otros que no contengan suficiente agente antirnicrobiano como para inhibir su desarrollo. La concentración de antibiótico que presente ausencia de crecimiento, detectada por falta de turbidez (igualando al control negativo), se designa como la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) (ver esquema ampliado).

Para medir la capacidad de un antimicrobiano para matar a un microorganismo (CMB) se debe realizar la prueba de actividad bactericida, que emplea el mismo sistema de dilución en caldo que para medir la sensibilidad.

Al mismo tiempo que la suspensión inicial del microorganismo es inoculada en los tubos de caldo, se toma una alícuota del tubo de control de crecimiento, inmediatamente después de ser sembrado, y se inocula también en una placa de agar para determinar el número real de unidades formadoras de colonias (UFC) del inóculo. Este número se obtiene al contar las colonias presentes luego de la incubación de la placa de agar hasta el día siguiente y por multiplicación por el factor de dilución. Por ejemplo, usando un asa calibrada de 0,01 ml para sembrar la placa y contando unas 250 colonias, en 1 ml del tubo original habrá 250/0,01.

Una vez determinada la CMI, se siembra una cantidad conocida de inóculo de cada uno de los tubos de caldo que no presentaban turbidez en placas de agar (la pequeña cantidad del agente antimicrobiano que es llevada junto con el inóculo se elimina por dilución en el agar), y el número de colonias que crece en estos subcultivos, después de incubar durante la noche, se compara con el número de UFC/ml del cultivo original. Dado que incluso las drogas bactericidas no siempre esterilizan totalmente una población bacteriana, la mínima concentración del agente antibacteriano que permite sobrevivir a menos de 0,1 % del inóculo original se denomina concentración bactericida mínima (CBM) o concentración letal mínima (CLM).

Las CMI y las CMB de un agente antimicrobiano pueden ser determinadas, con este método o con alguna variante, para cualquier bacteria que crezca en un medio liquido.

Pero según se pudo disponer de mayor número de agentes antimicrobianos para el tratamiento de una gran variedad de bacterias, se hicieron aparentes las limitaciones del macrométodo de dilución en caldo y se desarrollaron variantes de esta técnica que permitieran, por ejemplo, probar simultáneamente un gerrnen aislado de un paciente frente a más de un agente antimicrobiano.

Actualmente son varios los métodos que se utilizan para llevar a cabo los estudios de sensibilidad a los antibióticos y todos ellos se realizan en los laboratorios de microbiología bajo condiciones entandarizadas por organismos internacionales. Entre todos, tres son los que, por su sencillez y fiabilidad, se han impuesto como sistemática de rutinaria en la mayoría de los laboratorios: